Comment biologistes lisent un gène avec le séquençage d'ADN

Le séquençage d'ADN, qui détermine l'ordre des nucléotides dans un brin d'ADN, permet aux scientifiques de lire le code génétique afin qu'ils puissent étudier les versions normales de gènes. Il leur permet également de faire des comparaisons entre les versions normales d'un gène et versions pathogènes d'un gène.

Après ils savent l'ordre des nucléotides dans les deux versions d'un gène, ils peuvent identifier ce qui change dans le gène cause de la maladie.

Séquençage de l'ADN repose sur un type particulier de nucléotides, appelé ddNTP (court pour triphosphate didésoxyribonucléotide). ddNTP sont assez semblables à nucléotides d'ADN réguliers, mais ils sont assez différents qu'ils arrêtent réplication de l'ADN.

Quand un ddNTP est ajouté à une chaîne de plus en plus de l'ADN, l'ADN polymérase peut pas ajouter de plusieurs nucléotides de sorte que la chaîne en croissance arrête à ce moment-là. Séquençage de l'ADN utilise cette interruption de la chaîne afin de déterminer l'ordre des nucléotides dans un brin d'ADN.

La plupart séquençage de l'ADN fait aujourd'hui est séquençage cyclique (représentée sur la figure), un processus qui fonctionne comme PCR pour créer de nombreuses copies du gène à séquencer. Mais, contrairement à la PCR, ainsi que les ddNTP réguliers nucleotides sont ajoutés au mélange. Donc, comme l'ADN polymérase travaille loin faire de nombreuses copies du gène, il saisit chaque maintenant et puis un ddNTP (présentée comme rectangles blancs) à la place d'un nucléotide régulière (présentée comme rectangles noirs).

Après un ddNTP est ajouté à une molécule d'ADN en croissance, la reproduction est arrêtée. Le résultat du séquençage en cycle final est beaucoup de copies partielles du gène à séquencer, qui tous sont arrêtés en des points différents et sont par conséquent des longueurs différentes.

Après les copies partielles sont faites, les scientifiques les charger dans une machine qui utilise l'électrophorèse sur gel de mettre les copies dans l'ordre par la taille. Étant donné que les séquences partielles passent à travers la machine, un laser lit une étiquette fluorescente sur chaque ddNTP, qui révèle l'ordre des nucleotides dans le gène.

Testez votre ddNTP compréhension de la lecture de ces questions pratiques:

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   Un scientifique veut déterminer la séquence d'un gène associé à une maladie génétique. Elle prend des échantillons d'ADN d'une personne qui a la version pathogène du gène de les en quatre tubes séparés de test, contenant chacun nucléotides, l'ADN polymérase, et les amorces.

   Puis, dans chaque tube, elle ajoute un type de didésoxynucléotide - ddATP, ddGTP, ddCTP ou ddTTP - de telle sorte que chaque tube va produire des fragments d'ADN qui se terminent par un nucléotide particulier (A, G, C ou T). Après avoir exécuté les réactions de séquençage, elle charge les résultats de chaque tube dans un gel et sépare les fragments par électrophorèse sur gel.

   Sur la base des résultats de son gel, représenté sur cette figure, quelle est la séquence du gène?

   

2. Une jeune femme dont la mère est morte de la maladie d'Alzheimer à début précoce veut savoir si elle est à risque de développer la maladie. La maladie est causée par un allèle dominant, si la femme a une seule copie de l'allèle pathogènes, elle va développer la maladie.

   Décrivez comment un scientifique pourrait utiliser un échantillon de sang de la jeune femme à son dépister la présence de l'allèle pathogènes. Soyez sûr d'inclure toutes les techniques nécessaires, à commencer par l'échantillon de sang.

   Voici les réponses aux questions pratiques.

3. ADN se déplace vers l'électrode positive dans un gel, et les fragments plus petits déplacer la plus grande distance, de sorte que les bandes dans le gel qui sont les plus proches de l'+ sont les plus petits groupes.

   Le fragment le plus court (la bande la plus basse) est dans la voie qui a été chargé avec ddCTPs, de sorte que le premier nucléotide dans le brin d'ADN doit être C. La bande suivante est dans la voie qui a été chargé avec ddTTPs, de sorte que le nucleotide suivant doit être T .

   Le groupe suivant est à nouveau dans la voie C, de sorte que le nucléotide suivant doit être un C. Si vous continuez à lire le gel du côté + vers le côté - - en d'autres termes, à partir du bas vers le haut - vous pouvez déterminer la reste de la séquence d'ADN. La séquence complète est CTC AGC CAT AGG.

4. Le scientifique serait extraire l'ADN de l'échantillon de sang et ensuite utiliser soit le séquençage de l'ADN ou des enzymes de restriction pour déterminer si la jeune femme porte l'allèle pathogènes.

   Méthode de séquençage de l'ADN: Le scientifique lit les séquences des allèles de la jeune femme et les compare aux séquences connues des allèles normaux et pathologiques. Le scientifique sépare l'échantillon de l'ADN de la jeune femme et il met en quatre tubes. Chaque tube contient des amorces pour le gène de la maladie d'Alzheimer et beaucoup de nucléotides.

   L'un de chaque tube contient un ddNTP marqué par fluorescence différent: avec une ddATP, ddCTP à une, avec une ddGTP et ddTTP avec une. Le scientifique place les tubes dans un séquenceur de cycle, où ils vont à travers de nombreux cycles de réplication de l'ADN.

   Puis le scientifique dirige les échantillons à travers un gel qui les sépare par taille. L'ordinateur détecte le signal de fluorescence à la fin de chaque morceau d'ADN à partir de petit au plus grand et l'utilise pour reconstruire les séquences d'ADN pour les allèles de la jeune femme.

   Restriction de la méthode enzymatique: Le scientifique utilise PCR sur l'ADN du sang pour faire de nombreuses copies du gène associé à la maladie d'Alzheimer. Ensuite, le scientifique utilise une enzyme de restriction qui est connu pour couper différemment dans les formes normales et pathologiques du gène.

   Le scientifique coupe de l'échantillon de l'ADN de la jeune femme avec l'enzyme de restriction, puis sépare l'ADN par électrophorèse sur gel. Le scientifique compare les tailles des fragments d'ADN produites par l'ADN de la jeune femme au motif connu généré par les allèles normaux et pathologiques.